高血压病的基因治疗

高血压是一种高发病率、高致残率、高死亡率的疾病。目前中国有1亿多患者，美国有5000多万患者。高血压是引起冠心病、心肌梗死、脑出血和脑栓塞等疾病的常见诱因。高血压发病机制较为复杂。临床用于治疗和控制高血压的药物种类较多，但其控制效果不尽如人意。1997年，美国关于预防、检测、评估和治疗高血压全国联合委员会第六次报告显示，在接受治疗的高血压患者中只有27.4%的患者血压得以控制。此外，这些药物还存在作用时间较短、毒副作用较大、需终生服用等缺点。由于传统的高血压治疗药物无法预防高血压发生和降低高血压发病率，因此寻求新的高血压治疗方法和策略就显得十分必要和迫切。随着分子生物学技术的发展，高血压的基因治疗就自然而然地成为当前研究的热点。高血压基因治疗包括正义和反义两种方式。

1。 正义基因治疗高血压

正义基因治疗高血压是指以脂质体、腺病毒或逆转录病毒为载体，通过静脉注射或靶组织局部注射将目的基因转染到体内，使之表达相应蛋白以达到治疗高血压的目的。

1.1 肾上腺髓质素基因

肾上腺髓质素是由日本学者从切除的嗜铬细胞瘤组织提取液中分离提纯的一种多肽，由52个氨基酸组成人类的肾上腺髓质素，在体内具有舒张血管、促尿钠排泄和强心等作用。肾上腺髓质素在心肌细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞中均有表达，ADM具有扩张血管、抑制VSMC增殖迁移、增加肾血流量和促进钠排泄等作用。Chao等将构建的人ADMcDNA质粒通过尾静脉注射转染7周龄的自发性高血压大鼠，结果发现一次性注射ADM质粒后，ADM在肾、心和肺等组织中均稳定表达，并引起血压明显下降，持续5周以上在第一次转染5周后再追加注射一次，降压效果可继续维持3周，血压最多可下降2.93kPa。该实验提示转染人ADM基因可长时间降低血压。

1.2 心房利尿肽基因

心房利尿肽是在20世纪80年代以来被发现的一族活性肽，人体中最主要的是含28个氨基酸构成的多肽。ANP主要是由心房肌细胞合成和释放，通过舒张血管，降低外周阻力，增加肾小球滤过率，抑制肾素的释放，引起明显的尿钠和尿量增加等作用机制，达到降低BP的效果。心房利尿肽家族由三个成员组成，包括心钠素、脑钠素及C型ANP，是由17个氨基酸组成的环状结构。ANP主要有扩张血管、降低血压、抑制VSMC增殖和利钠利尿等作用。Lin等以腺病毒为载体将人ANP基因转染高盐饮食诱发的高血压大鼠，单次静脉注射ANP基因3d后，即引起血压下降并持续5周以上，血压最高降低4.37kPa，免疫学检测发现，ANP在心、肺、肾等器官中均有表达。ANP转染后肾血流、肾小球滤过率、钠排出量、尿量和尿cGMP水平明显增加。形态学检测亦发现心肌肥厚、肾小球硬化、肾小管及动脉增厚等现象明显减轻，表明转染ANP基因对高血压有较好的治疗效应。

1.3一氧化氮合酶基因

内皮细胞产生的NO有参与血压、血流调节、抑制血小板聚集、抑制内皮细胞和VSMC增殖等作用。一氧化氮在调节机体血压和局部血循环，抑制血小板聚集和内皮细胞、血管平滑肌细胞的增生增殖中都有重要作用。Lin等以巨细胞病毒将一氧化氮合酶基因通过尾静脉注射转染SHR，单次注射后即可引起血压明显下降，持续5～6周，追加注射可维持10～12周，血压最大下降2.80kPa。对其他指标检测表明，NOS基因转染后，尿及动脉中cGMP水平、尿及血清中亚硝酸盐/硝酸盐水平均明显增高，但大鼠体重、心率、摄水量、饮食量和尿量等指标均无明显变化。说明NOS基因转染在高血压及心血管疾病的治疗中可能具有较理想的应用前景[7]。另外，Alexander等实验证实以腺病毒为载体将人eNOS基因通过颈动脉注射后，可以改善原发性高血压脑卒中倾向大鼠的NO生物利用缺陷，恢复颈动脉的内皮功能，而超氧化物歧化酶则无此效应。从而为基因治疗原发性高血压及肾脏血管性疾病的研究提供了一条新途径。

1.4 血红素加氧酶基因

血红素加氧酶能促进亚铁血红素转变为胆绿素，释放游离铁和一氧化碳，两者均参与血管张力调节。Sabaawy等将载有人HO 1cDNA的逆转录病毒一次性注入5d龄SHR心肌中，结果发现大鼠表达HO 1并降低血压，HO 1基因表达表现为尿量减少、对动脉腔内压升高的反应性降低等。但值得注意的是，转染HO 1基因在降低大鼠血压的同时伴随明显的身体生长现象。

1.5 激肽释放酶基因

激肽释放酶是体内的一类蛋白酶，可使某些蛋白质底物激肽原分解为缓激肽。缓激肽具有舒张血管活性，可参与对血压和局部组织血流的调节。在人体和动物实验中证实，缓激肽是目前已知的最强的舒血管物质之一。Eric等给予DOCA-salt高血压大鼠模型静脉注射以腺病毒为载体的人组织激肽释放酶基因后，延迟BP升高时间达2 d，并且降压作用持续约23 d。与注射以腺病毒为载体的虫荧光素酶基因的对照组比较，注射人组织激肽释放酶基因的大鼠的最大降压幅度可达50 mm Hg，最小降压幅度也可达32 mmHg，并持续于整个实验期间。同时人组织激肽释放酶基因转染后， DOCA-salt高血压大鼠的尿量、尿蛋白水平和体重均降低。肾形态学检测显示肾小球硬化、肾小管扩张、蛋白管型等现象明显减轻。Costanza等以腺病毒为载体，将人组织激肽释放酶基因肌内注射转染自发性高血压大鼠后，结果显示人组织激肽释放酶基因可以促进BP正常的动物自发性代偿血管生成，特别重要的是能纠正SHR的血管再生缺陷。肾素结合蛋白基因等也在高血压实验治疗中取得了一定效果，表明高血压的正义基因治疗是一种有前途的治疗方法。

2。反义基因治疗高血压

反义基因治疗高血压是指以脂质体、腺病毒或逆转录病毒为载体，通过静脉注射或靶组织局部注射将能与靶基因结合的ASODN转染到体内，使之抑制特定蛋白表达，是用相应反义寡脱氧核苷酸或重组于表达载体上的反义核片段对引起血管收缩和高血压的过分表达的基因采取反义抑制或封闭，抑制复制、转录、转录后mRNA加工运输和翻译过程，从而抑制引起高血压的活性蛋白质的产生，降低血压并逆转与高血压有关的病理生理和形态学改变， 阻断缩血管物质的生成。目前在阻断缩血管物质生成方面，基因治疗的靶基因主要针对RAS系统的某些成分，如AGT和AT1基因。临床试验已经证明， RAS的抑制是治疗高血压的重要途径，已有4种反义成分用于高血压的治疗研究：反义AT1R、反义AGT、反义血管紧张素转换酶和反义β1-肾上腺素能受体。

2.1Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体基因

Gyurko等用血管紧张素Ⅱ受体亚型1成功降低SHR的血压。其方法是将抗AT-1受体mRNA的反义寡核苷酸注入SHR脑室内，然后测定AT-1受体和血管紧张素Ⅱ受体亚型2受体的数目的，并监测鼠的血压。结果显示：SHR丘脑下组织块中AT-受体数目减少20% ~30%， SHR血压明显下降，降压幅度可达49 mmHg，而且也能显著降低SHR由血管紧张素Ⅱ所诱发的饮水反应。上述结果为抗血管紧张素Ⅱ受体基因治疗高血压病提供了可靠的依据。Pachori等以逆转录病毒将AT1R的ASODN转染SHR，可使大鼠血压持续下降，说明反义基因治疗高血压在理论和实践中都是可行的。此外，用转肾素基因大鼠建立高血压及其相关心肌肥厚动物模型，以逆转录病毒将AT1R的ASODN一次性注入新生大鼠心肌中，结果发现ASODN能长时间持续抑制AT1R在心血管组织中的表达，虽然血压未降至正常水平，但心肌肥厚程度明显减轻而对照组大鼠心肌肥厚在16d已非常严重，说明局部组织转染ASODN能产生较理想的治疗效果。

2.2 酪氨酸羟基酶基因

Kumai等报道静脉注射酪氨酸羟基酶基因的ASODN可使SHR血压明显降低，肾上腺髓质中肾上腺素/去甲肾上腺素水平、TH酶活性和TH蛋白水平均明显下降，而给Wistar Kyoto大鼠静脉注射ASODN则对血压无明显影响，它能明显降低儿茶酚胺水平、TH酶活性及TH蛋白水平，说明全身应用抑制TH基因的ASODN对SHR的降压治疗是有效的。

2.3 血管紧张素原基因

在目前已研究过的高血压候选基因中，血管紧张素原基因被认为最有可能成为EH相关基因。人AGT基因位于染色体1 q 42~43。应用受累同胞对进行连锁分析，发现AGT基因与EH有明显连锁关系，多数报道证实，该基因的M235T变异体与高血压相关联，血浆AGT水平依次为TT>TM>MM基因型。最后一项研究表明，TT、TM型的收缩压和舒张压及血浆AGT浓度均显著高于MM型患者，此外，前者用降压药比例及用二种以上降压药的比例均显著高于后者。还有人报道，T235基因型高血压患者对血管紧张素转换酶抑制剂降压反应较为敏感。肾素血管紧张素系统在血压的调节和高血压病的发生、发展中起着重要作用。AGT是RAS中唯一能产生血管紧张素I的底物。Tomits等将他们所构建的抗AGT的反义寡聚脱氧核糖核苷酸用含有病毒凝集素的脂质体包裹后经门静脉注入自发性高血压鼠体内，使之与肝细胞融合传染SHR的肝脏，结果引起SHR的血浆AGT水平暂时降低，并伴随SHR肝脏AGTmRNA的降低，血浆AngⅡ浓度降低和血压暂时下降。注入反义ODNs后， SHR的血压从178 mmHg降压154 mmHg维持时间约1周。反义ODNs降压作用不能持久，如何延长降压作用时间也是今后研究的主要方向。

AGT作为RAS的重要化合物，在人和动物高血压的发生、发展中起重要作用，资料显示全身应用AGT基因的ASODN能降低SHR血压水平。Kimura等将重组腺病毒携带的AGT基因ASODN一次性注入5d龄的SHR心肌中，结果发现高血压发病推迟91d，且大鼠在成年后血压明显降低，并持续6个月。血压最大可降低3.07kPa，转染的ASODN在肝、肾、心脏中稳定发挥作用，能明显降低左室心肌肥厚和肝脏中AGT水平，且未见肝脏毒性作用发生。说明以rAAV转染AGT基因的ASODN能安全、稳定、长效地治疗高血压。

2.4 β1 肾上腺素能受体基因

β受体阻滞剂是高血压一线治疗药物，但因影响中枢神经系统和β2 肾上腺素能受体而产生许多副作用。Zhang等设计了特异性抑制β1 肾上腺素能受体mRNA的ASODN，以期能克服传统β受体阻滞剂的缺点并产生长期降压效果。结果显示，单次静脉注射以阳离子脂质体为载体的ASODN能明显降低心肌β1 AR密度，对β2 AR无影响，SHR血压最大可下降5.07kPa，持续20d，心率无明显下降，放射自显影检测脑组织中β1 AR无明显变化，而心、肾组织中则明显降低。同时观察的β受体阻滞剂阿替洛尔对SHR降压作用只维持了10h，而且还能诱发心动过缓。研究结果表明，与传统的β受体阻滞剂相比，抑制β1 ARmRNA表达的ASODN能更长久、更稳定地降低血压，而对心率、β2 AR和中枢神经系统无明显影响。

2.5 血管紧张素转化酶基因

ACE在RAS和高血压中的重要作用已被大量研究所证实，ACE抑制剂是目前临床常用的一类高血压治疗药物。Wang等重点研究了以下两个问题：抑制ACEmRNA的ASODN能否预防幼年SHR发展为高血压以逆转录病毒载体将ASODN转染自发性高血压双亲大鼠，观察其抗高血压表型是否遗传给子代。结果发现，给5d龄SHR心肌注射以逆转录病毒为载体的ACE基因ASODN，能长时间适度降低血压，降低kPa，且可以预防心血管及肾血管病理性变化的发生，并能减轻心室肥大，恢复肾动脉血压、受体依赖性收缩反应及内皮细胞功能而转染相同基因的Wistar Kgoto大鼠血压无明显变化，表明RAS在高血压的发病中起重要作用，从基因水平抑制该系统可能是长期控制高血压的一种有效方法。

该研究一个独特的发现是转染ACE基因ASODN的自发性高血压双亲大鼠能够将其获得的抗高血压表型遗传给子代，其子代与亲代一样血压降低、心肌肥厚减轻、肾动脉兴奋偶联正常、肾动脉内皮细胞功能正常。Southern印迹法及聚合酶链反应法检测结果表明，ACE基因ASODN已完整插入SHR亲代基因组并遗传给子代。这可能是子代SHR获得抗高血压表型的重要原因，该发现为具有家族遗传倾向的人类高血压的预防和控制提供了新思路。

2.6其他靶基因

其他一些基因，如促甲状腺激素释放激素、血管紧张素基因活化原、羧肽酶Y和c fos等基因的ASODN也具有降低血压和抑制VSMC增殖等作用。

不同的反义成分有不同的生物学效应和降压效果，同样的反义成分因其有无载体以及载体的种类或进入体内的途径不同，其降压效果以及对病理生理和形态学改变的改善程度是不一样的。但绝大多数文献报道已显示出了反义基因治疗的优越性：一次注射反义成分能长期降血压或延缓高血压的发生，并能预防或逆转与高血压有关的病理生理和形态学变化，且选择性高，不出现传统药物的副作用。现有的资料表明，反义基因治疗乃是将来控制人类高血压的一个有效的方法。

3 存在问题及展望

正义和反义基因治疗高血压所积累的大量实验资料充分说明基因治疗不但可以持续稳定降低血压，而且还可能从根本上控制高血压发生和控制高血压的家族遗传倾向，这是目前所有高血压治疗药物力所难及的。大量实验资料显示高血压的基因治疗有着令人鼓舞的前景，但是目前高血压病的基因疗法尚处于临床前的动物实验阶段，有许多问题仍然需要我们去克服和解决，目前主要存在的问题是： 理想靶基因的选择， 是高血压病治疗的前提，只有对高血压病的分子生物学机制有了透彻的了解，明确了发病的关键基因和相关基因，才有可能从基因水平诊治高血压病，而且高血压病是多基因异常疾病，这就给对给靶基因的界定和选择带来了一定困难， 因此，选择多靶点进行综合治疗应是高血压基因治疗研究的重要课题 载体构建。构建安全、高效、免疫原性低的载体是基因治疗一大热点。3基因转运系统的转运效率和靶向性等需进一步提高，转运系统对人体的长期影响需进一步明确。一般而言，直接基因转移法优于间接法。随着分子生物学和分子病理学理论与技术的发展，随着基因治疗整体水平的不断提高，我们相信基因治疗定能成为高血压病治疗的最佳有效途径之一。